Biomed. Environm. Mass Spectrom. 14, 1-4 (1987) aus dem Englischen übersetzt von G. J. Feistner

Kombination von Dünnschicht-Chromatographie und Massenspektrometrie ohne Substanz-Eluierung: Anwendung bei der direkten Identifizierung von Aminosäuren in Form ihrer dansylierten Ester.

Regine Kraft, Albrecht Otto, Hans-Jürgen Zöpli und Gerhard Etzold.

Zentralinstitut für Molekularbiologie, Akademie der Wissenschaften der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-1115 Berlin-Buch, Deutsche Demokratische Republik.

Aminosäuren können in Form ihrer dansylierten Methylester mittels Kombination von Dünnschicht-Chromatographie an Polyamid und nachfolgender Massenspektrometrie einwandfrei identifiziert werden, auch ohne daß die Substanzen vorher vom chromatographischen Polyamid-Trägermaterial eluiert werden müssen. Der Dampfdruck der Aminosäurederivate reicht aus, um ausgezeichnete Massenspektren mit wichtiger Strukturinformation zu erhalten, selbst bei nur geringen Mengen Ausgangsmaterial (Picomol-Bereich), was andererseits eine hohe Trennleistung bei der Dünnschicht-Chromatographie garantiert. Neben den Methylesterderivaten konnten teilweise auch Produkte isoliert werden, bei denen zusätzlich Methylierung am Sulfonamid-Stickstoff vorlag.

Einführung

Die chromatographische Trennung und Identifizierung von fluoreszierenden 5-Dimethylamino-naphthalin-1-sulfonyl-aminosäurederivaten (Dansylderivaten) auf Polyamid-Dünnschichtplatten ist, seit ihrer Einführung durch Woods and Wang [1], dank ihrer Einfachheit und Empfindlichkeit zu einer weitverbreiteten Methode geworden. Zwischenzeitlich sind auch verbesserte Laufmittelsysteme für die Trennung von allen üblicherweise in Proteinen vorkommenden Aminosäuren vorgeschlagen worden [2, 3]. Nach Laatsch [4] können, sofern ein geeignetes Laufmittelsystem benutzt wird, mehr als sechzig Dansylderivate von seltenen Aminosäuren reproduzierbar auf Polyamid-Dünnschichtplatten aufgetrennt werden [5]. Manchmal ist eine eindeutige Identifizierung durch Chromatographie allein allerdings schwierig, zum Beispiel bei seltenen Aminosäuren oder solchen mit sehr ähnlichen Rf-Werten. Aus diesem Grund haben Seiler und Mitarbeiter schon früher die Vorteile der Identifizierung von dansylierten Aminosäuren mit Hilfe der Massenspektrometrie herausgestellt, insbesondere in Verbindung mit chromatographischen Methoden. Bisher verlangten solche Studien allerdings die Eluierung der chromatographischen Flecken vom Trägermaterial, ein Prozeß, der unvermeidlich zu höheren Kosten und längerer Analysenzeit führt, sowie die Gefahr in sich birgt, mit dem Lösungsmittel Verunreinigungen einzuführen. Aus diesem Grunde war es besonders interessant zu untersuchen, ob die von uns entwickelte, und für Phenole, Steroide, Nukleoside, biogene Amine und Aminosäuren angewandte kombinierte Dünnschicht-Chromatographie/Massenspektrometrie ohne Substanz-Eluierung [7] generell für die Charakterisierung von Aminosäuren in Form ihrer Dansylderivate nützlich ist. In der Zwischenzeit ist diese bequeme und schnelle Methode auch mit Erfolg bei metabolischen Untersuchungen von Organophosphor-Pestiziden angewandt worden [8]

Experimenteller Teil

Material und Geräte

Chemikalien. Die Dansylaminosäuren für die Veresterung wurden entweder als Cyclohexylammonium oder Piperidinium Salze von Serva bezogen.

Veresterung. Eine frisch bereitete, etwa 4%ige etherische Diazomethan-Lösung wurde bei Raumtemperatur zu jeweils 1 Mol Dansylaminosäure getropft, bis die Gelbfärbung durch das Diazomethan nicht mehr verblaßte [9]. Anschließend wurde die Reaktion durch Ansäuern mit etwas Essigsäure beendet. Nach dem Einengen im Vakuum wurde der Rückstand für die Dünnschicht-Chromatographie in 2 ml Ethanol gelöst.

Dünnschicht-Chromatographie. Die Chromatographie wurde auf doppelt beschichteten Polyamid-Dünnschichtplatten von Schleicher & Schüll (F1700) durchgeführt. Um in den Massenspektren einen hohen chemischen Hintergrund, verursacht durch Additive in den Chromatographieschichten, zu vermeiden, wurden die Platten mit Chloroform vorentwickelt. Anschließend wurden 1-2 ml der veresterten alkoholischen Vorratslösung punktförmig aufgetragen und das Chromatogramm in 1,5 % Ameisensäure aufsteigend entwickelt. Die Entwicklung wurde beendet, wenn die Lösungsmittelfront etwa 3,5 cm gewandert war. Nach dem Trocknen im Luftstrom wurde das Chromatogramm unter ultraviolettem Licht betrachtet und die stark fluoreszierenden Flecken mit einem Bleistift umrandet.

Massenspektrometrie. Die Spektren wurden mit einem Massenspektrometer MS 902S der Firma A.E.I. (Manchester) unter Elektronenstoß-Bedingungen (70 eV, 500 mA Emissionsstrom) aufgenommen. Die individuell markierten Flecken im Chromatogramm (Fläche etwa 3 x 3 mm, entsprechend etwa 80-120 mg Trägermaterial) wurden sorgfältig vom Stützmaterial abgelöst, indem die Polyamidschicht mit einem Spatel aufgerollt wurde. Dies erlaubte die problemlose Einführung in den Quarztiegel mittels einer Pinzette. Wenn das Material in Pulverform anfiel, wurde das Herausfallen des Analysenmaterials mit Glaswolle verhindert. Die angemessene Verdampfungstemperatur wurde indirekt über die Ionenquellenheizung erreicht und ist für die untersuchten Verbindungen in Tabelle 1 angegeben (etwa 180-250 oC, wobei die Ionenquellentemperaturanzeige, die bei 0 oC anfing, um 20 oC aufwärts korrigiert wurde). Das Auftreten der Fragmentionen bei m/z 170/171, die von der Dansylgruppe herrührten, diente als Anhaltspunkt für das schnelle Erreichen der optimalen Verdampfungstemperatur.

Ergebnisse

Für die optimale Kombination von Dünnschicht-Chromatographie und Massenspektrometrie ohne Substanz-Eluierung sind zwei Vorbedingungen entscheidend: Einerseits soll das Überladen der Dünnschichtplatte vermieden werden, um eine gute Trennleistung zu erreichen; andererseits muß genügend Substanz in die Gasphase gelangen, damit ein Massenspektrum aufgenommen werden kann. Vorversuche mit Alanin, Isoleucin, Prolin, und Phenylalanin zeigten, daß diese Bedingungen durch Dansylierung der Aminosäuren allein nicht erreicht werden können. Die Menge an Dansylaminosäuren, die für ausreichende Verdampfung vom Polyamid-Trägermaterial in die Ionisierungsquelle des Massenspektrometers benötigt wurde, betrug etwa 3 nMol. Bei diesen Substanzmengen würde die Polyamidschicht beträchtlich überladen. Im Fall von Dansyl-Glutaminsäure, die zwei Carboxylgruppen besitzt, war nicht einmal mit 4 nMol eine massenspektrometrische Identifizierung ohne vorhergehende Eluierung zu erreichen, da sehr hohe Temperaturen für die Verdampfung notwendig waren. Dies Verhalten zeigte eine besonders intensive Wechselwirkung der Carboxylgruppen mit der Polyamid-Matrix an. Um diese Adsorption zu reduzieren, wurden die Dansylaminosäuren in ihre Methylester überführt. Aufgrund ihrer leichten Verdampfbarkeit waren sie schon von Marino und Buonocore [10] als geeignetere Derivate für massenspektrometrische Untersuchungen vorgeschlagen worden. Daher wurden die Dansylaminosäuren in Methanol gelöst, mit einer ethanolischen Diazomethan-Lösung bei Raumtemperatur behandelt, und Aliquots von 0,5 bis 2 nMol der veresterten Lösung anschließend an Polyamid chromatographiert. In vielen Fällen wurden im Anschluß an eine eindimensionale Chromatographie in 1,5 % Ameisensäure nicht nur ein, sondern zwei deutlich getrennte Flecken mit fast gleicher Fluoreszenzintensität beobachtet. Offensichtlich hatte diese oft angewandte Veresterungsmethode, die im allgemeinen als "schonend" angesehen wird, nicht zu einheitlichen Produkten geführt.

Obwohl nur geringste Substanzmengen vorlagen, konnten, im Anschluß an die Überführung in die Probentiegel des Massenspektrometers, für eine Identifizierung geeignete Massenspektren erhalten werden. Es ergab sich, daß in den Proben, die zwei UV-aktive Flecken ergaben, der Fleck mit dem niedrigeren Rf-Wert jeweils einem übermethylierten Derivat entsprach.

Schema 1 zeigt die normale Veresterung (Position 1), sowie die Stellen, die für eine Übermethylierung in Frage kommen, nämlich den Sulfonamid-Stickstoff (Position 2) oder, im Falle der Aminosäuren mit drei funktionellen Gruppen, die Seitenkette (Position 3):

Abbildung

Für die massenspektrometrische Strukturbestimmung der verschiedenen Methylderivate (siehe Tabelle 1) wurden vor allem folgende Kriterien benutzt. Position 1: Verlust der Methoxycarbonylgruppe vom Molekularion [M-59]+.. Position 2: Massenverschiebung des Dansylamid-Kations m/z 250 um 14 Masseneinheiten nach m/z 264. Position 3: Auftreten von charakteristischen Fragmentierungen der Seitenkette.

In Fall von Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin und Prolin wurde jeweils ein chromatographisch einheitliches Produkt erhalten, welches den erwarteten dansylierten Aminosäure-Methylestern entsprach (Position 1). Im Gegensatz dazu ergaben dansyliertes Glycin, Alanin und Phenylalanin jeweils zwei Produkte, von denen das mit dem höheren Rf-Wert ebenfalls der erwarteten Struktur entsprach.

Die Spektren der Verbindungen mit dem niedrigeren Rf-Wert (Position 2) zeigten Übermethylierung an (M+. des Esters + 14 u). Die Massenverschiebung des Dansylamid-Kations um 14 Masseneinheiten im Massenspektrum von Phenylalanin bestätigte diese Vermutung.